کروماتوگراف مایع با کارایی بالا  High Performance Liquid Chromatograph (HPLC) |

تکنیک HPLC امروزه به عنوان تکنیکی بسیار قوی و قدرتمند جهت تجزیه کمی مواد دارویی، شیمیایی و تجزیه پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک است. از میان تکنیک‌های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را دارد. ساليانه ميليون ها دلار صرف خريد و فروش دستگاه‌هاي  HPLC در دنيا مي‌شود. علت اين رشد را مي‌توان به حساسيت بالا، تعيين مقدار کمي با صحت بالا، قابليت آناليز نمونه‌هاي غيرفرار و حساس به دما که با تکنيک (GC )کروماتوگرافي گازي امکان پذير نيستند، نسبت داد.

کروماتوگراف مایع با کارایی بالا چگونه کار می‌کند؟
در سيستم HPLC يک سوزن مخصوص وارد پيشستون مربوطه مي‌شود. همزمان از يک محلول مخصوص جهت ترکيب شدن با نمونه استفاده مي‌شود. سپس نمونه با محلول مورد نظر ترکيب شده و وارد ستون مربوطه مي‌شود و بر اساس ميزان قطبيت محلول و ترکيب از يکديگر جدا مي‌شوند. همچنين نمونه براساس زمان بازداري از يکديگر تفکيک مي‌شوند. دتکتورهاي دستگاه کروماتوگرافي نه تنها توانايي شناسايي اجزاي موجود در فاز متحرک را دارند بلکه امکان اندازه‌گيري غلظت آنها را نيز در آزمايشگاه آناليز دستگاهي فراهم مي‌آورند. طيف گسترده‌اي از آشکارسازها براي شناسايي انواع مختلف ماده در آزمايشگاه وجود دارند. هر دتکتوري تنها به گروه خاصي از ترکيبات پاسخ مي‌دهد و اين پاسخ هيچ ارتباطي به اجزاي موجود در فاز متحرک ندارد.

کاربردکروماتوگراف مایع با کارایی بالا
کاربرد گسترده آن براي موادي است که در صنعت، زمينه‌هاي مختلف علوم و جامعه اهميت درجه اول را دارند. مثال‌هايي از اين موارد عبارت اند از: اسيدهاي آمينه، پروتئين‌ها، اسيدهاي نوکلئيک، هيدروکربن‌ها، هيدرات‌هاي کربن، داروها، ترپنوئيدها، حشره‌کش‌ها، آنتيبيوتي‌کها، استروئيدها، گونه‌هاي آلي و گروهي از مواد گوناگون معدني، جداسازي، خالص‌سازي، شناسائي پروتئين‌ها و ترکيبات آلي به ويژه ترکيبات دارويي. همچنين در برخي از آزمايش‌هاي مربوط براي تعيين غلظت داروها، در تحقيقات پروتوميک (تحقيقاتي که برروي پروتئين‌ها انجام مي‌شود)، آناليز و هضم پروتئين و مقايسه ساختارهاي پروتئين‌هاي مختلف و تعيين ساختار پليمرها مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

اجزاء و قسمت‌هاي مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهيزات HPLC شامل قسمت‌هاي مختلفي مانند مخازن حلال، موتور يا پمپ، تزريق‌کننده، ستون و آشکارساز است که در تصویر زیر نشان داده شده است.

مخازن حلال

که در آن‌ها فاز متحرک و یا حلال‌‌های شست‌و‌شو دهنده ستون ریخته شده است.

پمپ (Pump)

کار پمپ دستگاه اچ‌پی‌ال‌سی آن چنان که از نامش پیداست، پمپاژ حلال و یا حلال‌ها با فشار بسیار زیاد تا حدود 40 مگا پاسکال و یا بیشتر به سمت ستون کروماتوگرافی است. این واحد معمولاً از یک تا چهار حلال را به سمت ستون پمپاژ می‌نماید که بسته به متدهای کاری تغییر می‌کند. در مواقعی که از یک حلال در دستگاه HPLC استفاده می‌شود به آن اصطلاحاً ایزوکراتیک یا تک حلاله گفته می‌شود. در مواقعی نیاز هست تا از ترکیب ثابت دو یا چند حلال و یا ترکیب متغیر با زمان (برنامه زمانی) استفاده شود که به این سیستم باینری و یا کواترنری یا چند حلاله و یا گرادیانت می‌گویند. سیستم‌های باینری معمولاً از سر هم‌بندی یا کوپلینگ 2 پمپ همزمان ساخته می‌شوند و در مواقعی با استفاده از یک سیستم شیر چهار مسیره قابل کنترل با کامپیوتر که به ورودی پمپ متصل شده می‌توان از ترکیب ثابت و یا متغیر با زمان همه حلال‌ها استفاده نمود.

انژکتور (Injector)

انژکتور Injector)) در واقع نقش تزریق‌کننده نمونه مورد آنالیز به داخل حلال عبوری را در دستگاه کروماتوگراف مایع بازی می‌کند. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیرکه می‌تواند بین پمپ و ستون قرار گرفته و بتواند در حین عبور حلال یا فاز حامل با فشار زیاد مقدار معینی از نمونه را به داخل آن هدایت نماید. مقدار ثابت نمونه در داخل لوله‌ای با حجم مشخص به نام لوپ در کمین نشسته تا در لحظه فرمان کاربر سوار موج حلال شده و به سمت ستون کروماتوگرافی حرکت نماید. انژکتور اتوماتیک و یا Autosampler نیز نوع رباتیک این سیستم می‌باشد که می‌تواند تعداد بسیار زیادی از نمونه را طبق برنامه داده شده کاربر به داخل حلال تزریق نماید.

ستون (Column)

ستون کروماتوگرافی و یا column مرکز جداسازی اجزای نمونه در کروماتوگرافی مایع است. ستون HPLC لوله‌ای است فلزی که با مواد نیمه تراوا از جنس خاک دیاتومه با خلل و فرج فراوان پر شده است که حلال و نمونه حل شده تنها با اعمال فشار از داخل آن عبور داده می‌شود. عملکرد این ستون‌ها به زبان ساده نگهداری و رهاسازی مولکول‌های جزء به جزء ترکیب به ترتیب بزرگی و یا چسبندگی مولکول‌ها و قدرت شستشوی نمونه توسط حلال می‌باشد. ستون‌ها بسته به جنس محتوا و قطبیت و طول دارای انواع بسیار متنوعی می‌باشند که از مصطلح‌ترین آن‌ها ستون C18 و C8 می‌باشد.

آشکار ساز (Detector)

دتکتور دستگاهی است که بنابر خاصیتی مثل میزان جذب می‌تواند غلظت نمونه را دستگاه کروماتوگراف مایع بسنجد، در بیشتر موارد دتکتور کروماتوگراف یک سیستم اسپکتروفتومتر است که در طول موج خاصی می‌تواند مقدار و نوع نمونه را نمایش دهد و این دتکتور SPD نامیده می‌شود. از دیگر دتکتورهای کروماتوگراف می‌توان از دتکتور RID نام برد که بر اساس ضریب شکست نمونه آن را شناسائی و مقدارسنجی می‌نماید. دتکتور RF، براساس میزان فلورسانس نمونه. دتکتور MS براساس جرم مولکولی.

کنترل کننده (Controller)

کنترلر در دستگاه کروماتوگراف مایع بخشی است که ماژول‌های دیگر را کنترل نموده و ارتباط همه بخش‌ها و کامپیوتر را برقرار می‌نماید. در پایان اطلاعات اجزای ترکیب به صورت نمودار یا اصطلاحاً کروماتوگراف روی نمایشگر قابل دستیابی است.

گازگیر (Degasser)

قبل از ورود حلال به داخل پمپ در دستگاه  HPLC، باید هر گونه حباب هوا و یا گاز دیگر و یا هوای حل شده در حلال از آن زدوده شود. این کار به دو روش تزریق گاز بی اثر مثل آرگون در داخل حلال در حین لرزاندن حلال و دیگری استفاده از دستگاه گازگیر صورت می‌گیرد. امروزه در دستگاه HPLC بیشتر از دستگاه Degasser استفاده می‌شود که سیستم نیمه تراوای داخل آن گاز را تراوش نموده ولی اجازه خروج مایع را نمی‌دهد.

انواع دتکتور دستگاه HPLC
دتکتور UV-Vis، دتکتور PDA، شناساگر RI، دتکتور فلورسانس، دتکتور ELSD، دتکتور هدايت الکتريکي،  دتکتور CLD، دتکتور  Ms، دتکتور OR، دتکتور ES، دتکتور  MALS.

References
[1] http://lab.arshiaweb.ir
[2] http://labnews.ir
[3] http://raynoor.com
[4] http://edu.nano.ir